Très tôt fascinée par le cinéma, la lyonnaise Sylvie Testud, n'envisage réellement de devenir comédienne qu’à l’âge de 18 ans, après son bac. Elle part donc à Paris dans le but de suivre en auditrice libre, l’enseignement du cours Florent, suite à quoi elle intègre le Conservatoire : Dominique Valadié, Jacques Lassalle et Catherine Hiégel seront ses professeurs de 1993 à 1996. Après quelques timides propositions, une véritable opportunité s’offre à elle, pour jouer, outre-Rhin, dans Maries lied de Niko Brücher.

Succès, le film la fait connaître en Allemagne et lui permet de décrocher immédiatement un nouveau premier rôle dans Jenseits der stille de Caroline Link. Elle apprend pour ce dernier la langue de Goethe, la clarinette et le langage des signes et livre une performance qui lui vaut, en 1997, l’équivalent allemand du César de la meilleure actrice.

Il faut attendre 1999 pour que les français découvrent ce jeune talent, nominé au César du meilleur espoir féminin pour un film de Thomas Vincent, Karnaval. Avec ce mélange singulier de douceur et de violence, Sylvie Testud impose sa signature artistique dans Marée haute de Caroline Champetier, Sade de Benoît Jacquot, La Captive de Chantal Akerman mais surtout dans Les Blessures assassines de Jean-Pierre Denis : son incarnation troublante de Christine Papin est récompensée par le César du meilleur espoir en 2001.

Interprétant des personnages aussi variés que surprenants, elle s’en remet à Manoel de Oliveira pour Je rentre à la maison, s’adonne à la danse argentine dans Tangos volés d’Eduardo de Gregorio et plonge dans un conflit familial avec Aime ton père de Jacob Berger en 2002. Deux ans plus tard lui est décerné le César de la meilleure actrice pour Stupeurs et tremblements d’Alain Corneau. Explorant la veine burlesque dans Cause toujours de Jeanne Labrune et Demain on déménage de Chantal Akerman, elle revient au mélodrame en 2005 dans Les Mots bleus, seconde collaboration avec Alain Corneau.

Cette popularité au cinéma ne doit pas faire oublier son activité théâtrale remarquée dans La Cour des comédiens et Six fois deux, dirigés par Georges Lavaudant, Moonlight de Pinter ou Stella de Goethe, et en 2005 La Pitié dangereuse d’après Stefan Zweig, adaptée et mise en scène par Philippe Faure. Enfin, depuis 2003, l’écriture vient se greffer à son actualité cinématographique et théâtrale avec deux romans, Il n’y a pas beaucoup d’étoiles ce soir et Le Ciel t’aidera, publiés comme le dernier en date Gamines chez Fayard.

Début 2007, elle est à l'affiche de La Môme d'Olivier Dahan, La Fortune de Laurent de Bartillat puis La France de Serge Bozon, La Vague noire d'Antoine Le Bos et tourne pour Diane Kurys le personnage de Françoise Sagan.