Née à Paris, d’un père chinois et d’une mère française, Gilberte Tsaï grandit à Lyon où elle fonde la compagnie Théâtre Tsaï dans les années 1970. Elle travaille ensuite en collaboration avec le Théâtre National de Strasbourg et avec l’Atelier lyrique du Rhin.

Au Festival d’Avignon elle participe à la création de "Tembouctou"(1982) puis présente Voyage en Chine intérieure (1986), spectacle pour vingt comédiens, chanteurs et musiciens chinois, repris à Paris puis en tournée un peu partout dans le monde. En 1987, elle obtient une bourse Villa Médicis hors les murs lui permettant de faire un séjour en Chine. A la fin des années 80, sa carrière s'ouvre à l'international : au Lincoln Center de New York, dans le cadre du bicentenaire de la Révolution Française, elle crée Tales of Exile, d’après Italo Calvino (1989).

Gilberte Tsaï dirige aussi des enfants dans deux montages originaux de textes contemporains s’adressant à un public d’adultes : Celui qui ne parle pas et Turbulences. Souvent auteure et metteure en scène tout à la fois, Gilberte Tsaï développe un mode de création singulier qui vise la transformation et le métissage de matériaux concrets et souvent non dramatiques en une forme théâtrale et poétique : Tableaux impossibles (1991) qui s'inspire des tableaux rêvés de sept peintres contemporains, La Main verte (1994) spectacle sur les jardins créé en collaboration avec le paysagiste Gilles Clément, Noces de bambou (1998) écrit en collaboration avec Jean-Christophe Bailly à partir de récits d’émigration recueillis auprès de la communauté asiatique de la région parisienne mais aussi Song (1999) composé de récits et de chansons retraçant cinquante ans d’histoire contemporaine de la Chine. Entre 1999 et 2008, elle présente Une Nuit à la bibliothèque, de Jean-Christophe Bailly à Paris et en tournée dans plusieurs villes de France et d’Italie (Turin, capitale mondiale du Livre), puis en Russie et en Iran.

Directrice du Centre dramatique national de Montreuil de 2000 à 2011, Gilberte Tsaï met en scène La Nuit blanche, montage à partir des textes d’Arlette Farge et de divers écrits du XVIIIème siècle, le triptyque Sur le vif, spectacle accompagné de Ricochets : trois petites formes jouées en appartement. En janvier 2008, elle inaugure la salle du Nouveau Théâtre de Montreuil avec une adaptation de Ce soir on improvise de Luigi Pirandello. Puis, elle met en scène en 2009, Vassa 1910, une adaptation de l’œuvre de Maxime Gorki. En février 2010 elle traduit et met en scène une pièce inédite en France Le Mystère du bouquet de roses de Manuel Puig.

En 2010, elle créé à Limoges puis au Jardin-Ecole de Montreuil Parcours sensible dans les jardins, spectacle déambulatoire pour neuf comédiens autour de la relation des hommes au jardin et le présente dans les domaines de Chamarande, de Marne et Gondoire et au Château de la Roche Guyon. En 2011, elle créé au Nouveau Théâtre de Montreuil Le Jeu de l’Ile d’après trois pièces utopiques de Marivaux : L’Ile des Esclaves, L’Ile de la raison, La Colonie. En juin 2011, elle fonde la compagnie L'Equipée au sein de laquelle elle poursuit son travail et met en scène "S'envoler, conte boréal", une adaptation du roman de Selma Lagerlöf : "Le merveilleux voyage de Nils Holgerson à travers la Suède". En 2013, adaptation pour France-Culture du livre de François Maspero « Les passagers du Roissy-Express » feuilleton diffusé en 10 épisodes. En 2014 Dans le cadre de l'anniversaire des 50 ans de collaboration France-Chine, elle écrit et met en scène "L'ombre perdue" à Langzhong et Chengdu (Sichuan).

Elle programme depuis 2001 un cycle de conférences intitulé "Lumières pour enfants", s'adressant à un public à partir de dix ans, conférences éditées dans une collection qu’elle dirige aux Éditions Bayard. Ces conférences ont lieu chaque année au Nouveau théâtre de Montreuil, à l'Opéra de Bordeaux, à L'IMEC Abbaye d'Ardenne, et au Théâtre des Sablons de Neuilly.